細胞核與線粒體的分級分離

細胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的比重和巨細都不相同，在同一離心場內(nèi)的沉降速度也不相同，依據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細胞內(nèi)各種組分分級別離出來。<o:p></o:p> 別離細胞器最常用的辦法是將安排制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進行別離，其過程包含安排細胞勻漿、分級別離和剖析三步，這種辦法已成為研討亞細胞成分的化學組成、理化特性及其功用的主要手法。<o:p></o:p> 勻漿（Homogenization）低溫條件下，將安排放在勻漿器中，參加等滲勻漿介質(zhì)（即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣）進行破碎細胞使之成為各種細胞器及其包含物的勻漿。<o:p></o:p> 分級別離（Fractionation）由低速到高速離心逐步沉降。先用低速使較大的顆粒沉積，再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉積下來，從而使各種細胞結(jié)構(gòu)，如細胞核、線粒體等得以別離。<o:p></o:p> 因為樣品中各種巨細和密度不同的顆粒在離心開始時均勻分布在整個離心管中，所以每級離心得到的第一次沈淀必定不是純的最重的顆粒，須經(jīng)重復懸浮和離心加以純化。<o:p></o:p> 剖析  分級別離得到的組分，可用細胞化學和生化辦法進行形態(tài)和功用判定。<o:p></o:p> 細胞核的別離提取<o:p></o:p> （一）操作過程<o:p></o:p> 1．用頸椎脫位的辦法處死小白鼠后，敏捷剖開腹部取出肝臟，剪成小塊（去除結(jié)締安排）盡快置于盛有0.9％NaCl的燒杯中，重復洗滌，盡量除掉血污，用濾紙吸去外表的液體。<o:p></o:p> 2．將濕重約1g的肝安排放在小平皿中，用量筒量取8ml預冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝安排后，再悉數(shù)參加。<o:p></o:p> 3．剪碎的肝安排倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿筆直插入管中，上下轉(zhuǎn)動研磨3～5次，用3層紗布過濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片①，做好符號，天然枯燥。<o:p></o:p> 4．將裝有濾液的離心管配平后，放入一般離心機，以2500rpm，離心15分鐘；（1）慢慢取上清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待別離線粒體用；（2）同時涂一張上清液片②做好符號，天然枯燥；（3）余下的沉積物進行下一過程。<o:p></o:p> 5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液懸浮沉積物，以2500rpm離心15分鐘棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于潔凈的載玻片上，涂片③，天然枯燥。<o:p></o:p> 6．將①、②、③涂片用l％甲苯胺蘭染色后蓋片即可調(diào)查。<o:p></o:p> （二）成果<o:p></o:p> 別離于高倍鏡下調(diào)查三張涂片，描述鏡下所見。<o:p></o:p> 高速離心別離提取線粒體<o:p></o:p> （一）操作過程<o:p></o:p> 1．將裝有上清液的高速離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000rpm離心20分鐘，棄上清，留取沉積物。<o:p></o:p> 2．參加0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化鈣液lml，用吸管吹打成懸液，以17000rpm離心20分鐘，將上清吸入另一試管中，留取沉積物，參加0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣溶液混勻成懸液（可用牙簽）。<o:p></o:p> 3．取上清液和沉積物懸液，別離滴一滴于潔凈載玻片上（別離符號④、⑤涂片），各滴一滴0.02％詹納斯綠B染液蓋上蓋片染20分鐘。<o:p></o:p> （二）成果<o:p></o:p> 油鏡下調(diào)查，顆粒狀的線粒體被詹納斯綠B染成藍綠色。<o:p></o:p>

產(chǎn)品分類

細胞核與線粒體的分級分離